腺嘌呤核苷三磷酸可通过多种细胞途径产生。最典型的如在线粒体中通过氧化磷酸化由三磷酸腺苷合酶合成，或者在植物的叶绿体中通过光合作用合成。 腺嘌呤核苷三磷酸合成的主要能源为葡萄糖和脂肪酸。每分子葡萄糖先在细胞质基质中产生2分子丙酮酸同时产生2分子腺嘌呤核苷三磷酸，最终在线粒体中通过三羧酸循环产生最多36分子腺嘌呤核苷三磷酸。腺嘌呤核苷三磷酸的立体结构在细胞中腺嘌呤核苷三磷酸的摩尔浓度通常是1至10。