二氧化碳的固定，是在叶绿体的基质中进行的。基质中有进行C固定反应的酶类。光反应阶段是在内囊体膜上进行的。

光合作用分为光反应和暗反应两个步骤。二氧化碳是暗反应的原料，二氧化碳通过叶片的气孔进入植物体从而进入细胞中的叶绿体基质，在叶绿体基质中二氧化碳与C5化合物结合形成C3化合物，这个过程叫做二氧化碳的固定，所以二氧化碳的固定在叶绿体基质中进行。